一、微生物污染
尽管标准建议对微生物含量进行评估，但微生物含量本身并不影响指定的纯度等级。可接受的微生物数量需要单独评估；这种评估基于对 GMP 的解释。例如，2004 年美国食品及药物管理局无菌灌装指导文件指出 (4)：“压缩气体应具有适当的纯度（如不含油），其过滤后的微生物和颗粒质量应等于或优于气体引入环境中的空气质量”。在纯度方面，制药行业的许多部门将根据允许的最大颗粒数使用 1 级压缩气体。颗粒限制为：
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ISO 8573等级
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每m³颗粒限制
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0.1~0.5μm
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0.5~1.0μm
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1.0~5.0μm
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1
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≤20000
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≤400
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≤10
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除 ISO 8573 标准外，辅助信息载于《ISPE 良好操作指南--工艺气体》（2011 年）(5)。ISPE 指南中的表 7.1（参考附录 1）指出，颗粒计数（可存活的和惰性的）应为 “通常等于所服务区域的静止状态"。也就是说，对于欧盟 GMP A 级/ISO 14644 5 级区域，微生物数量应小于 1 CFU/m³，颗粒水平应符合区域静止状态 ≤ 3,520 个颗粒/m³ @ > 0.5μm。
对于压缩空气的生产，也有单独的标准（ISO 12500）。ISO 12500 没有具体的微生物测试要求。
二、微生物存活率
根据上述情况，微生物的最大含量将适用于洁净室等级。这就严格限制了 ISO 14644 5 级/欧盟 GMP A 级区域。
虽然压缩气体和空气系统的环境相对恶劣，但如果有可用的营养物质，它们也能帮助微生物存活。营养物质的可用性取决于气体和空气的纯度。适合微生物代谢的营养物质包括水和油滴。另一个影响生存的因素是温度，尤其是在气温较高的地方。(斯图尔特等人，1995 年）
除了无性细胞，细菌孢子也能在恶劣的环境条件下生存。孢子对压缩气体管道内的温度范围和湿度水平有很强的抵抗力。另一个风险是生物膜，微生物群落可能会通过附着在气管和管道上而形成和发展。
虽然存在这些风险因素，但通常不会从压缩气体管路中回收微生物。研究表明，许多微生物可以在压力高达 10 巴的加压系统中存活和繁殖，大约 85% 的微生物在加压后能够恢复。(Zinge, 2013）此外，研究还表明，大肠埃希氏菌（Escherichia coli）和枯草棒状杆菌（Corynebacterium xerosis）可在 300 atm（= 300 bar）的极限减压条件下存活，而这与压缩气体采样器中 10 bar 至 1 atm 的减压条件相差甚远。(Zinge, 2013）
然而，在 160 巴压力（2,320.6 磅/平方英寸）及以上的压力下，存活率往往相当低。(Sandle, 2015 年 8 月）
虽然压缩空气或气体中的微生物污染很少发生，但还是有可能发生，即使是低水平的计数也需要进行调查。污染源包括：
• 气体来源。来自周围环境的吸入空气，其中可能含有油、污垢/灰尘、湿气/水蒸气和微生物。
• 管道分配系统。管道分配和储气罐在旧系统中更为常见，除细菌外，还会有铁锈、管垢和矿物质沉积等形式的污染物。
• 细菌滞留过滤器。过滤器可能会堵塞、失去完整性或变湿。
• 压缩机故障。压缩机本身会造成污染环境。例如，压缩机的预过滤器可能因灰尘和绒毛过多而导致过滤器无法正常工作。
• 取样阀。使用点取样阀可能设计不当或出现故障。此外，阀门的类型也可能选择不当 - 应该是特氟龙阀门。
三、需要减压
在对压缩气体进行采样时，必须调节进入颗粒计数器或微生物空气采样器的流量。如果不能调节流速，可能/将会导致一些问题：
• 粒子计数器： 该仪器根据粒子计数器流速下的预期电响应对粒子进行计数和尺寸测量。电脉冲越大，颗粒的尺寸就越大。反之，电脉冲越低，颗粒越小。因此，将 50 psi 等高压源直接连接到 50 LPM 粒子计数器上，会导致气体中的任何粒子以明显加快的速度飞过视体积（粒子计数器内被激光束饱和的区域），并导致粒子尺寸严重偏小。
• 微生物空气采样器：除其他因素外，微生物采样器的流速和入口几何形状（即采样头中孔的数量和直径）都是经过计算的，以便为存活的微生物撞击琼脂提供一定的速度。必须根据 ISO 14698 标准对这一流速和入口几何形状进行物理和生物效率测试。将 50 psi 等高压源直接连接到 100 LPM 微生物采样器会提高物理回收率，但加快的撞击速度会导致微生物回收率显著下降。更简单地说，这将对生物效率产生严重的不利影响。(Stewart 等人，1995 年）琼脂干燥是另一个令人担忧的问题。无论使用何种生长培养基，将其置于高流速下都可能导致琼脂干燥，从而进一步降低生物效率。
• 可能造成灾难性损害： 将高压气体强行注入颗粒计数器或微生物采样器可能会导致排气过滤器发生灾难性故障。它还可能导致泵或真空源损坏以及其他损坏。
• 样品体积不确定性： 粒子计数器或微生物采样器的采样时间基于仪器的流速。例如，在 100 LPM 的流速下，一个立方米的采样时间需要 10 分钟。显然，直接将高压气体连接到仪器上很可能会导致采样严重过量。
大多数制药气体的储存压力通常在 10-11 巴（145 - 160 psi）或更高。然后，气体会经过一个调节器，将压力降低到一般介于 4-7 巴（55 - 100 psi）之间，再经过一个 HEPA 过滤器。即使在此压力下，也需要进一步降低压力，将气体降至大气压水平（约 1.1 巴），以便颗粒计数器或微生物采样器正常将气体吸入仪器。
四、消毒
微生物采样器的头部和任何附件在使用前必须无菌，以避免污染和交叉污染。与仪器一起使用的培养基应是无菌的（通常是通过辐照），并对具有代表性的培养基 进行过促进生长测试。样本头、试管和适配器应可高压灭菌。有些用户会用 70% 异丙醇等消毒剂对连接采样器的管道和软管进行消毒。ISO 标准中将此作为一个选项，但却错误地将其描述为 “消毒”。在使用消毒剂的情况下，必须在没有琼脂板的情况下让空气流过采样器；这对蒸发消毒剂和去除任何残留物都是必要的。消毒剂的存在有可能导致假阴性。
五、琼脂和培养
压缩空气取样应与洁净室评估一起构成环境监测计划的一部分。该计划应考虑到需要检测的空气点。这可以是每个点，也可以是被认为风险较大的点，如产品接触点，或者是环路上的代表性点。还必须根据风险评估考虑检测频率。
采样时间应足以采样一立方米的气体。取样后，取出琼脂平板，在微生物实验室内进行培养。培养结束后，检查琼脂是否有菌落形成单位。如果发现菌落形成单位，则应根据适当的限值对其进行评估。良好的做法是对回收的污染物进行鉴定；鉴定可提供重要信息，帮助确定细菌的来源，以及是否是令人反感的物种。[Sandle, 2015］
在培养基方面，Climet CI-9xA 系列可将空气样本收集到 90 毫米培养皿或 RODOC 平板上。
必须选择适当的琼脂。根据 USP <1116>，大豆酪蛋白消化培养基 (SCDM) 等普通微生物生长培养基在大多数情况下都适用于环境监测，因为它能支持多种细菌、酵母菌和霉菌的生长。这种培养基可作为补充，以尽量减少消毒剂或抗生素的影响（USP <1116>）。此外，为测量细菌量而采集的空气样本使用 TSA（胰蛋白酶大豆琼脂）或大豆酪蛋白消化液 (SCDM) 作为采集生物的生长培养基，而为检测空气中的真菌量而采集的空气样本则使用 MEA（麦芽糖提取物琼脂）或沙伯呋喃葡萄糖琼脂。值得注意的是，只有被归类为高风险的复方制剂才需要进行真菌检测（USP 1116，修订公告，第 25 页）。
不过，大多数药品都使用 TSA，这是一种营养性一般的培养基，旨在回收各种细菌和真菌。(Sandle, 2015）
琼脂培养基应尽快从采样器中取出，并转移到所需的培养箱中。这是为了避免培养基变干或变质。
在选定的培养条件下，时间和温度应适合回收各种微生物，尤其是革兰氏阳性微生物，因为这类细菌更适合在干燥的环境中生存（Moissl Eichinger, 2012）。
典型的要求是寻找中嗜性细菌和真菌（可在 20-30 摄氏度的温度范围内生长的细菌和真菌）。一些用户会选择使用一种代表性温度，而另一些用户则会选择使用两步培养法，例如： (Sandle，2014 年；和 USP <1116>)
• 20-25℃ 3-5 天，然后是
• 30-35℃ 3-5 天。
选定的培养时间应基于促进生长的研究。如果某些微生物被认为是一个问题，可考虑使用其他培养时间或培养基。
六、取样阀
无论是进行可行或不可行测试，开/关阀门都应完全打开。我们不建议用户尝试手动调节压力，而是让高压扩散器发挥其作用。如果排出的气体过多，可能需要换一个扩散器。
七、取样频率
用户需要确定每条压缩气体管路是否需要检测以及检测的频率。当然，所有与产品接触的压缩气体都应进行评估。取样计划还应考虑并适应以下情况：
• 增加或减少的生产计划
• 季节性变化
• 设备变更和修改
• 更换硬件或过滤器和干燥器
• 系统闲置。
八、测试报告样本
样本测试报告见 ISO 8573-4 附件 A（非活性颗粒）和 ISO 8573-7 附件 A（活性颗粒）。