1. 微生物验证简介
微生物验证是制药生产中污染控制策略的核心，尤其适用于无菌和无菌工艺。它需要通过文件化证据证明所有系统、环境和工艺都能有效防止微生物污染。从洁净室和水系统到灭菌周期和人员操作规范，每个环节都必须符合要求，才能保持微生物控制状态。
根据EU GMP 附录1和FDA 无菌工艺指南，对于可能危及患者安全的区域，需要进行微生物验证。其目标是确保无菌——确保最终产品高度可靠地不含活体微生物。
本文探讨了制药厂微生物验证的关键组成部分、方法和监管要求。
2. 微生物验证的范围
微生物验证的范围涵盖无菌和非无菌生产环境中的多个系统和流程。其中包括：
· 洁净室设计和分类
· 环境监测（可行和不可行的）
· 无菌工艺模拟（培养基灌装）
· 灭菌工艺验证（湿热、干热、过滤）
· 人员资格（手套印记、防护服验证）
· 消毒剂和杀孢子剂功效验证
· 水和 HVAC 系统微生物验证
· 微生物限度测试（生物负载、内毒素）
在无菌生产中，所有这些系统都是相互关联的——任何一个系统出现问题都可能导致系统故障。在非无菌生产中，微生物验证可确保微生物水平在药典限度内。
随着监管机构对附件 1 和 ALCOA+ 合规性的要求越来越严格，微生物验证已成为审计和检查期间的重点关注领域。
3. 环境监测验证
环境监测 (EM) 是无菌和非无菌制药环境中最关键的微生物控制要素之一。EM 验证可确保空气、表面和人员始终符合微生物清洁度标准。根据附件 1 和 PDA TR13，EM 验证包含以下方面：
· 可行性监测：空气采样（主动和被动）、表面拭子和接触板，用于总需氧微生物计数（TAMC）和真菌检测。
· 非活性监测：粒子计数器检测空气中的≥0.5µm 和≥5.0µm 颗粒物，这可能与微生物侵入风险相关。
· 恢复验证：证明所使用的培养基和接触板能够从表面或人员手套中恢复低水平的微生物。
EM 验证要求洁净室按照 ISO 14644-1 或欧盟 GMP A/B/C/D 级进行分类。数据必须显示微生物趋势保持在警戒限值和行动限值范围内，并使用趋势分析来发现早期变化。应使用记录在案的 CAPA 流程调查超标情况。
监管机构要求培养基灌装方案、批次记录和年度质量审核中应包含菌落计数数据。采样地点应根据风险和历史污染模式进行合理确定。
4. 培养基灌装（无菌工艺模拟）验证
培养基灌装研究是验证无菌生产的黄金标准。该研究使用无菌培养基（例如胰蛋白酶大豆肉汤）代替实际产品，模拟完整的无菌工艺。其目标是证明无菌技术、环境和人员能够持续有效地防止污染。
培养基灌装验证包括：
· 最坏情况的模拟：必须包括生产线停止、操作员转换、延长填充和干预。
· 批次大小等效：在数量和持续时间方面模拟全尺寸生产批次。
· 孵化条件：培养基容器孵化 14 天（20–25°C 孵化 7 天，30–35°C 孵化 7 天）。
· 验收标准：根据 FDA 和 EMA 指南，高风险无菌灌装需要连续 3 个批次中 0 个受污染单位。
培养基灌装失败需立即调查根本原因，并可能暂停商业化生产。所有干预措施必须记录在案，并通过手套印迹和防护服取样来评估操作员的表现。
必须在初始验证时以及每 6 个月（对于无菌工艺）或任何重大变更（例如，设备、布局、HVAC 重新认证）后进行培养基灌装。
5. 消毒剂和杀菌剂功效验证
洁净室的消毒方案必须经过验证，以确保用于墙壁、地板和设备的消毒剂具有杀灭微生物的功效。验证必须证明消毒剂能够有效杀灭设施内常见的植物性微生物和产孢微生物。
验证步骤包括：
· 挑战菌的选择：包括内部分离菌、ATCC 菌株和抗性孢子，如枯草芽孢杆菌或嗜热土芽孢杆菌。
· 表面材料兼容性：对不锈钢、环氧涂层板、玻璃等进行测试。
· 接触时间研究：验证在建议的接触时间（例如 10 分钟）内杀灭效果。
· 中和剂功效：确保恢复介质中和消毒剂，使其不会抑制微生物的生长。
消毒剂轮换也必须经过验证，以避免耐药性累积。杀孢子剂应每周或每次风险评估时加入。杀菌剂供应商、浓度或施用工具发生变化时，应重新验证。
应提供消毒验证报告以供检查，并在清洁标准操作程序和设施资格协议中引用。
6. 水系统和暖通空调微生物验证
水系统（纯水、注射用水和纯化水）和暖通空调系统是需要严格微生物验证的关键设施。受污染的水或空气会损害无菌产品的完整性，尤其是在无菌操作中。
水系统
制药用水的微生物验证包括：
· 总活菌数 (TVC)： PW 通常≤100 cfu/mL，WFI 通常≤10 cfu/100 mL。
· 内毒素检测：注射用水≤0.25 EU/mL，采用 LAL 或重组因子 C 方法。
· 生物膜控制：经过验证的消毒（热或化学）和常规生物膜擦拭。
采用基于风险的选择方法验证采样点（例如，死角、用户点、回路回流）。水系统再验证通常每年进行一次，并在维护后进行。
暖通空调系统
HVAC 验证包括 HEPA 过滤器完整性测试、气流可视化（烟雾研究）和空气微生物采样。洁净室加压、恢复时间和颗粒计数必须符合 ISO 或欧盟标准。微生物验证包括监测空气污染和过滤器抵御微生物入侵的有效性。
7. 人员资质和手套采样
人员是洁净室中最常见的微生物污染源。微生物验证必须包括通过穿戴评估和指尖采样来验证操作员的资质。
关键组件包括：
· 初步确认：穿戴防护服后对手套印记、防护服表面进行取样，以确保没有污染。
· 常规监控：在培养基填充或批量生产期间通过指尖采样。
· 培训验证：确保操作员在干预期间遵守无菌行为和 SOP。
对于A级检测，手套指纹的警报和处理水平通常小于5 cfu，且结果必须随时间变化趋势。对于结果持续超标的操作员，应进行重新认证和再培训。
8. 灭菌周期和生物指标验证
灭菌工艺（湿热灭菌、干热灭菌、过滤灭菌、环氧乙烷灭菌）需要进行微生物学验证，以确保无菌保证水平 (SAL) 达到 10⁻⁶。这通常使用生物指示剂——放置在最坏情况发生位置的抗性孢子来完成。
验证步骤包括：
· BI 放置研究：在热量/渗透最少的负载位置。
· D值和Z值的测定：孢子在特定条件下的抗性特性。
· 半周期研究：证明亚致死暴露下的对数减少。
灭菌验证必须包括连续三次成功运行，并记录所有生物指示剂回收率和控制结果。维护或负载配置更改后，需要重新验证。
9. 结论
微生物验证是一门涵盖多个方面的学科，是药品生产中污染控制的基础。它涵盖环境监测、无菌模拟、实用验证和人员卫生等各个环节，旨在确保产品无菌和患者安全。
随着监管指导的不断发展，特别是欧盟附件 1 的修订以及对基于风险的污染控制策略的更多关注，微生物验证的深度和严谨性比以往任何时候都更加重要。
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